OLYMPUS CKX53倒置顯微鏡熒光升級(jí)及
活/死細(xì)胞雙色熒光染色（AO/PI法）檢測應(yīng)用解決方案

基于 CKX-UVBG-E 電動(dòng)智能熒光模塊的標(biāo)準(zhǔn)化細(xì)胞活性評(píng)估指南

圖 1：加裝 CKX-UVBG-E 電動(dòng)智能熒光模塊后的 OLYMPUS CKX53 倒置熒光顯微鏡整機(jī)結(jié)構(gòu)

一、 方案背景與 AO/PI 雙色熒光檢測原理

在細(xì)胞生物學(xué)、組織工程、腫瘤學(xué)評(píng)估及原代細(xì)胞提取過程中，精準(zhǔn)鑒別細(xì)胞存活狀態(tài)是核心檢測步驟。吖啶橙（Acridine Orange, AO）與碘化丙啶（Propidium Iodide, PI）聯(lián)合使用的雙色熒光染色法，能夠特異性標(biāo)記質(zhì)膜完整性。相較于傳統(tǒng)臺(tái)盼藍(lán)明場染色，AO/PI 雙色熒光法能夠有效排除原代樣品中的無核紅細(xì)胞、細(xì)胞碎片及雜質(zhì)干擾，展現(xiàn)出更高的檢測特異度與識(shí)別準(zhǔn)確率。

1.1 AO 與 PI 熒光探針的作用機(jī)制

二、 CKX53 倒置顯微鏡熒光升級(jí)方案（CKX-UVBG-E 模塊）

常規(guī)奧林巴斯 CKX53 顯微鏡主要用于明場及相襯活細(xì)胞觀察。通過加裝專為 CKX53 量身開發(fā)的 CKX-UVBG-E 電動(dòng)智能熒光模塊，無需更換顯微鏡主體即可快速升級(jí)為高性能倒置熒光顯微平臺(tái)：

2.1 高度集成一體化與內(nèi)陷槽緊湊安裝設(shè)計(jì)

CKX-UVBG-E 模塊將大功率 LED 光源與熒光激發(fā)塊高度集成于單一盒體內(nèi)，采用了內(nèi)陷安裝槽與殼體卡扣設(shè)計(jì)，結(jié)構(gòu)緊湊且外部固定螺絲少。升級(jí)后熒光模塊極薄，不遮擋載物臺(tái)下方空間，確保物鏡轉(zhuǎn)換順暢無阻。

圖 2：CKX-UVBG-E 熒光模塊在 CKX53 載物臺(tái)下方的內(nèi)陷式緊湊安裝結(jié)構(gòu)

2.2 電動(dòng)智能通道切換與 1.44 英寸彩色大屏

模塊配備 1.44 英寸彩色顯示屏，以彩色方柱和百分比數(shù)值清晰顯示當(dāng)前通道狀態(tài)及激發(fā)光亮度。實(shí)體按鍵與編碼標(biāo)記讓通道切換一目了然；配合防滑指壓旋鈕，單指即可快速旋轉(zhuǎn)與點(diǎn)擊操控，極大提升了實(shí)驗(yàn)效率。

圖 3：CKX-UVBG-E 1.44英寸彩色大屏與單指防滑多功能操控旋鈕

2.3 長壽命 LED 光源與通道光強(qiáng)智能記憶

采用大功率 LED 光源（使用壽命 > 30000 小時(shí)），即開即用，無需傳統(tǒng)高壓汞燈繁瑣的預(yù)熱與冷卻等待。系統(tǒng)支持多達(dá) 4 色獨(dú)立熒光通道，內(nèi)置通道光強(qiáng)記憶功能——當(dāng)在 B 通道（檢測 AO 綠光）與 G 通道（檢測 PI 紅光）之間切換時(shí)，模塊能自動(dòng)還原之前設(shè)定的光照強(qiáng)度，避免重復(fù)微調(diào)導(dǎo)致樣本熒光淬滅。

圖 4：CKX-UVBG-E 電動(dòng)智能熒光模塊外觀與顯示控制面板

2.4 低風(fēng)噪主動(dòng)循環(huán)散熱與軟件聯(lián)動(dòng)擴(kuò)展

模塊內(nèi)置低風(fēng)噪、低震動(dòng)風(fēng)扇進(jìn)行主動(dòng)循環(huán)風(fēng)散熱，有效保障 LED 燈珠與濾光片的溫度穩(wěn)定，防止光譜中心波峰漂移。同時(shí)，模塊支持外部協(xié)議通訊與軟件聯(lián)動(dòng)控制，可無縫對接電腦端的圖像采集與分析軟件。

三、 AO/PI 雙色熒光檢測標(biāo)準(zhǔn)解決方案流程

為確保升級(jí)后的 CKX53 顯微鏡在進(jìn)行 AO/PI 雙色檢測時(shí)獲得高信噪比與高重復(fù)性的數(shù)據(jù)，建議遵循以下標(biāo)準(zhǔn)化實(shí)施流程：

步驟 1：試劑準(zhǔn)備與細(xì)胞樣品洗滌

• 工作液配制：使用無熒光背景的 PBS 緩沖液將 AO 與 PI 母液稀釋成雙染色工作液（推薦終濃度：AO 約 5–10 μg/mL，PI 約 10–20 μg/mL），現(xiàn)配現(xiàn)用并避光保存。

• 樣品洗滌：取待測貼壁或懸浮細(xì)胞，用溫育的 PBS 輕輕洗滌 1–2 次，消除培養(yǎng)基成分及殘余血清對熒光染色的干擾。

步驟 2：樣品混合染色與短時(shí)溫育

• 染色混合：將 AO/PI 混合工作液與細(xì)胞懸液按 1:1 比例充分混合（或直接加至細(xì)胞培養(yǎng)孔中），使染色液均勻覆蓋細(xì)胞。

• 避光溫育：室溫避光孵育 5–10 分鐘。由于 AO/PI 與核酸結(jié)合迅速，建議在 20 分鐘內(nèi)完成上樣與圖像采集。

步驟 3：CKX53 上樣與明場/相襯快速定位

• 放置樣品：將染色后的血球計(jì)數(shù)板或培養(yǎng)皿置于 CKX53 載物臺(tái)上，使用 Universal Holder 固定。

• 相襯尋焦：開啟 LED 明場光源，利用 iPC 整合相襯系統(tǒng)（4X–40X 切換無需換相襯環(huán)）快速尋找代表性視野并完成對焦。

步驟 4：電動(dòng)智能熒光通道切換與采集

• B 通道采集（活細(xì)胞）：通過 CKX-UVBG-E 單指按鍵一鍵切換至 B 激發(fā)通道（FITC），LED 光源開啟，采集綠色胞質(zhì)/胞核熒光圖像（綠光細(xì)胞為活細(xì)胞）。

• G 通道采集（死細(xì)胞）：按下按鍵快速切換至 G 激發(fā)通道（TRITC），智能還原預(yù)設(shè)紅光功率，采集紅色胞核熒光圖像（紅光細(xì)胞為死細(xì)胞/膜受損細(xì)胞）。

步驟 5：圖像合成與細(xì)胞存活率定量評(píng)估

• 圖像傳輸與疊加：通過相機(jī)接口將圖像傳輸至電腦，利用配套分析軟件對 FITC 綠光通道與 TRITC 紅光通道進(jìn)行 Overlay/Merge 通道疊加。

• 存活率計(jì)算：分別統(tǒng)計(jì)視野內(nèi)的綠光活細(xì)胞數(shù)（Live）與紅光死細(xì)胞數(shù)（Dead），計(jì)算細(xì)胞存活率：Vitality (%) = [Live / (Live + Dead)] × 100%。

四、 典型圖像結(jié)果與數(shù)據(jù)評(píng)估

在 CKX53 優(yōu)良光學(xué)系統(tǒng)與升級(jí)后 CKX-UVBG-E 模塊的支撐下，AO/PI 雙色染色呈現(xiàn)出分明的形態(tài)學(xué)與熒光光譜特征：

圖 5：升級(jí)熒光系統(tǒng)后獲取的高信噪比多色細(xì)胞熒光觀察成果圖譜

五、 規(guī)范操作注意事項(xiàng)與設(shè)備保養(yǎng)建議

5.1 染色觀察時(shí)間控制：AO/PI 與核酸結(jié)合迅速，染色混合后建議在 20 分鐘內(nèi)完成觀察。時(shí)間過長可能導(dǎo)致 AO 濃度游離變化或 PI 被活細(xì)胞少量吞噬造成假陽性。

5.2 LED 激發(fā)強(qiáng)度適度調(diào)控：充分利用 CKX-UVBG-E 模塊的無級(jí)調(diào)光與光強(qiáng)記憶功能，在拍攝對比度滿足的前提下適當(dāng)調(diào)低激發(fā)功率，減緩熒光探針淬滅。

5.3 風(fēng)扇風(fēng)道防堵與清潔：保證熒光模塊側(cè)面主動(dòng)散熱風(fēng)扇的風(fēng)道通暢，避免遮擋，定期用干燥氣吹清理風(fēng)扇網(wǎng)罩灰塵。

5.4 鏡片與部件擦拭維護(hù)：若載物臺(tái)或物鏡沾染培養(yǎng)基或染色液，應(yīng)及時(shí)用 75% 乙醇濕潤無塵紙輕輕擦拭，保持優(yōu)良的透光性能與設(shè)備衛(wèi)生。